層析硅膠的分離原理是根據(jù)硅膠的不同吸附能力來分離物質(zhì)。一般來說，極性較大的物質(zhì)容易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不容易被硅膠吸附。整個色譜過程是吸附、解吸、再吸收和再吸收的過程。試劑柱色譜硅膠是一種具有固體特性的膠體體系，由具有凝集結(jié)構(gòu)的膠體顆粒組成。膠體顆粒是硅膠(聚硅酸)在水合狀態(tài)下的縮聚物，是無定形的。膠體顆粒聚集的間隙在硅膠顆粒內(nèi)部形成微孔結(jié)構(gòu)。因此，它是一種具有豐富微孔結(jié)構(gòu)、高比表面積、高純度和高活性的高質(zhì)量吸附材料。

層析硅膠的微觀結(jié)構(gòu)與普通硅膠沒有什么不同。形成膠體框架的二氧化硅是二氧化硅和氧的四面體組合，原子間的力場處于平衡狀態(tài)。如前所述，硅膠具有非常高的比表面積。硅膠顆粒內(nèi)部孔隙的表面結(jié)構(gòu)不同于骨架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。表面上的硅原子和膠體中包含的結(jié)構(gòu)水形成硅烷醇基。也就是說，這種結(jié)構(gòu)的不平衡使硅膠表面產(chǎn)生一個自由力場，即它具有吸附水分子或其他極性分子的能力，而被吸附的物質(zhì)是由于分子極性，膠體顆粒表面的吸附力隨強(qiáng)度而變化。因此，硅膠對不同物質(zhì)的混合物的吸附是有選擇性的。

當(dāng)分子極性強(qiáng)的組分通過硅膠表面時(shí)，硅膠產(chǎn)生的吸附力也很強(qiáng)，組分在硅膠表面的保留時(shí)間更長；相反，具有弱分子極性的組分的保留時(shí)間較短。因此，由于在通過硅膠的過程中保留時(shí)間的不同，不同物質(zhì)的混合物被分離。對于分子極性強(qiáng)的物質(zhì)，硅膠有很強(qiáng)的吸附能力，如水分子。在這種情況下，被吸附的分子只能獲得足夠的能量(如熱能)來克服硅膠表面產(chǎn)生的重力場的勢壘，并遠(yuǎn)離硅膠表面。這樣，在正常條件下，當(dāng)含有強(qiáng)極性物質(zhì)組分的混合物通過硅膠柱層時(shí)，混合物中的強(qiáng)極性物質(zhì)組分保留在硅膠孔中，從而顯示出硅膠脫水和精制或純化物質(zhì)的能力。