反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團（ODS）稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文介紹反相色譜柱的選擇和使用：

一、反相色譜柱的選擇

    1．柱子的PH值使用范圍

     反相柱優(yōu)點是固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，層析硅膠廠家在使用時一定要注意流動相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動相的PH值小于2時，會導(dǎo)致鍵合相的水解；當PH值大于7時硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。

    2．填料的端基封尾（或稱封口）

     把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。

二、液相色譜柱的使用

     色譜柱在使用前，進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是適用條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

    1、樣品的前處理

    a、使用流動相溶解樣品。

    b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不 可逆吸附的雜質(zhì)。

    c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。

    2、流動相的配制

     液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

    a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。

    b、流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)

    c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

    d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

    e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進行。 

    f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

    3、流動相流速的選擇

     因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

當選用適合的流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

    a．含水流動相在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖 溶液作為流動相不要過夜。加入疊氮化鈉，防止細菌生長。

    b．流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。

    c．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。